Phenotypic, genotypic characterisation and antimicrobial susceptibility determination of Lactococcus garvieae Strains

In this study, phenotypic and genotypic features of 10 L. garvieae strains isolated from rainbow trout farms were examined with 3 reference strains (Spain, England and ATCC 43921) comperativly. Rapid 32 STREP and conventional microbiologic tests were used for determining phenotipic features of L. garvieae strains. Altough there are differences, in Rapid 32 STREP system, between strains in terms of beta-Glucuronidase, D-ribose, sorbitol, lactose, raffinose, alanyl-phenylalanyl-proline arylamidase, pyrrolidonyl arylamidase, hippurate hydrolysis, urease tests, all strains have been confirmed as L. garvieae by API web. In RAPD PCR analysis, in which ERIC 2 primer is used, L. garvieae isolates were genotyped within 3 separate clusters according to similarity coefficient index of 70%, and it was detected that a vast majority of isolates with Turkey-origin (8 isolates) belongs to predominant type LG1 genotype. In addition to this, antimicrobial tests of L. garvieae strains shows that there are resistance against gentamycin, neomycin, lincomycin, sulfamethoxazole-trimethoprim, oxytetracycline, erythromycin, amoxicillin, florfenicol and doxycycline, which are frequently used on fish in our country

First Report of Chryseobacterium sp. from Koi (Cyprinus carpio) in Turkey

In this study, we isolated Chryseobacterium sp. from koi in Turkey. The disease outbreak occurred in fish weighing 10-300g (water temperature 9-10°C) in November 2011- February 2012. The cumulative mortality rate was approximately 55% over 4 months. Infected koi exhibited anorexia, weakness, emaciation, damage to dorsal and caudal fins, grey-white skin discoloration (1-1.5cm) in the head area, large open wounds in skin with disease progression, necropsy findings, paleness of the liver, enlarged spleen and kidney, acidic fluid in the body cavity. Samples for bacteriological examinations were collected from the kidney, liver, and spleen using sterile swabs; these samples were streaked onto Anacker ordal Agar and incubated at 18°C for 48 h. Five bacterial isolates were obtained from diseased fish. Phenotypic characteristics of the isolates were determined by conventional methods and rapid identification kits, API 20NE, and API ZYM. Comparative 16S rRNA gene sequence analysis demonstrated that isolate Sin57 belonged to the genus Chryseobacterium, with highest sequence similarity (98.5 %) to C. aahli T68T and C. limigenitum SUR2

The Hidden Though Flourishing Justification of Intellectual Property Laws: Distributive Justice, National Versus International Approaches

Bu çalışmada, Gökkuşağı alabalıklarında enfeksiyonoluşturan Ichthyophthirius multifiliis’infarklı bölgelerden izole edilmiş saha suşlarının genotipik yapıları temelindeimmundominant özellik gösteren rekombinant immobilizan antijenlerini(i-antijen) kodlayan genlerin bakteriyel ekspresyon sistemine klonlanarakeksprese ve karakterize edilmeleri, antijenik profillerinin ortaya çıkarılmasıve aşı adayı olabilecek rekombinant antijenlerin elde edilmesi amaçlanmıştır.&nbsp;Çalışmada 2018 ve 2019 yıllarının Temmuz ve Ağustos ayları arasında Gökkuşağıalabalığı yetiştiriciliğinin yoğun yapıldığı Samsun, Rize, Kayseri, Elazığ,Burdur, Antalya ve Muğla illerinde bulunan işletmeler ziyaret edilerek balıkpopülasyonları üzerinde saha araştırmaları yürütülmüş ve I. multifiliis ile enfekte bulunan balıklardan ilgili protokolleregöre izolasyon gerçekleştirilmiştir. Laboratuvara uygun solüsyonlar ve soğukzincir altında intikal ettirilen örneklerden cDNA ve gDNA izolasyonlarıgerçekleştirilmiştir. I. multifiliis i-antijengen lokusunun amplifikasyonu amacıyla optimum primer dizaynı için ön çalışmalaryürütülmüş ve hedef gen bölgeleri uygun amplifikasyon koşullarında PCR’daçoğaltılmıştır. Elde edilen amplikonlar agaroz jel üzerinden saflaştırılmıştır.Multiple gen lokusu sekanslarının belirlenebilmesi amacıyla ilgili pürifiyeamplikonlar pJET 1.2 plazmit vektörüne CloneJET PCR cloning kit (Thermo FisherScientific) kullanılarak klonlanmış ve katı besi yerinde belirlenenkolonilerden rekombinant plazmid DNA izolasyonları gerçekleştirilmiştir. Rekombinantplazmidler spesifik primerlerle çift yönlü olarak sekanslanmış vekromotogramlar De Novo Assemble üzerinden işlenerek hedef insert sekanslarvektör plazmid DNA’sı içerisinden çıkarılmış ve konsensüs sekanslar eldeedilmiştir. İlgili primerlerin i-antijen gen lokusu içerisinde çoğalttığı fragmentlerinbelirlenebilmesi amacıyla PCR ürünleri ayrıca yeni nesil dizileme teknolojisi (NGS)kullanılarak işlenmiş ve elde edilen dizilimlerin gen veri tabanlarındakimevcut tüm i-antijen gen lokusları ile filogenetik ilişkileri araştırılmıştır.Tüm bu araştırmalar sonucu karakterize edilen i-antijen genlerinin ekspreseettiği proteinlerin rekombinant olarak eldesi için çalışmalargerçekleştirilmiştir. Aşı adayı potansiyeli olabilecek bazı lokusların bakteriyelekspresyon sistemine aktarımı için kodon optimizasyonları yapılarak pET-32a(+)ekspresyon plazmid DNA’sına (Novagen) klonlanması gerçekleştirilmiştir. Eldeedilen rekombinant plazmitler E. colikompotent BL21(DE3) hücrelerine transforme edilerek optimum koşullardaekspresyon çalışmaları yürütülmüş ve ekspresyon etkinliği SDS-PAGE ve WesternBlot analizleri ile belirlenmiştir. Eksprese edilen rekombinant i-antijenproteinleri afinite kromotografi kulanılarak saflaştırılmış ve immunreaktiflikleri Western Blot analizleri ile tespit edilmiştir.&nbsp;Çalışmada,Elazığ, Rize ve Muğla illerinde ziyaret edilen işletmelerdeki Gökkuşağıalabalıklarında deri ve solungaçlarından hazırlanan preparatların mikroskobikincelemeleri ile I. multifiliisenfeksiyonunun yaygın olduğu görülmüştür. İlgili bölgelerden elde edilen I. multifiliis suşlarına ait cDNA vegDNA izolatlarının i-antijen gen lokusunun dizayn edilen pirmerlerle PCR’daamplifiye edilmesi sonucu 1200-1300 bp büyüklüğünde amplikonlar saptanmıştır.Pürifiye amplikonların klonlanması sonucu ilgili izolatlara ait açık okumaçerçevesi (ORF) sekanslarının analizinde birbirleriyle %38,3-58,8 arasındafarklılık gösteren 4 farklı i-antijen izoformu tespit edilmiştir. Bu izoformlararasında bir antijenik lokusun (ImulTR1-iant) her üç ildeki alabalıkpopülasyonlarından izole edilen I.multifiliis suşlarında da var olduğu NGS analizlerinde görülmüştür.ImulTR1-iant ORF sekansı ayrıca Amerika Birleşik Devletleri’nde alabalıklardanizole edilmiş bir i-antijen izoformuyla %83,3 identiklik gösterirken, diğertespit edilen izoformlara ait sekansların GenBank veri tabanında mevcuti-antijen sekanslarından oldukça farklı olduğu belirlenmiştir. Araştırmadarekaombinant i-antijen eldesi için yaygın belirlenen ImulTR1-iant izolatıüzerinden analizler yürütülmüştür. Bu izoformu kodlayan gen bölgesinin 1263bpbüyüklüğünde olduğu ve ORF’nin 420 amino asitten teşekkül ettiğibelirlenmiştir. ORF amino asit sekanslarının in-slico analizlerde 42,552 kDabüyüklüğünde bir proteini eksprese ettiği, bu proteinin sitoplazmik olduğu vetransmembran bölge içermediği tespit edilmiştir. Ayrıca ilgili ORF sekansıiçerisinde uzunluğu 7-22aa arasında değişen 21 antijenik bölge olduğubelirlenmiştir. Kodon optimizasyonu yapılmış olan ImulTR1-iant izoformuna ait pET-32a(+)rekombinant plazmitinin E. colikompotent BL21(DE3) hücrelerine transformasyonu ve ekspresyonu sonrasındayapılan SDS-PAGE analizlerinde in-silico analiz sonuçlarına paralel olarakyaklaşık 43kDa’luk protein jel üzerinde görüntülenmiştir. İlgili rekombinantprotein afinite kromotografide HisTrap FF crude (GE Healthcare) kolonlarıkullanılarak saflaştırılmış ve pürifiye rekombinant antijenin immun-reaktifliğiWestern-Blot analizleriyle gösterilmiştir.&nbsp;ErciyesÜniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TOA-2017-7742 kodnumarasıyla desteklenen bu çalışma ile Türkiye’de gökkuşağı alabalıklarındasorun oluşturan ve ekonomik kayıplara yol açan I. multifiliis suşlarına karşı biyoteknolojik aşı geliştirilmesinoktasında aşı adayı olabilecek immobilizan antijenler üzerine özgün veriler sağlanmıştır.Elde edilen aşı adayı rekombinant antijenlerin etkinliğini ortaya koymanoktasında laboratuvar ve saha şartlarında immunizasyon ve çelınç enfeksiyondenemeleri için yeni proje çalışmaları planlanmaktadır.</style

Effects of Enzyme-Producing Probiotic Bacteria Isolated from the Gastrointestinal Tract of Trout on the Growth Performance, Survival, and Digestive Enzyme Activity of Rainbow Trout Fry (Oncorhynchus mykiss)

In this study, we investigated the effects of enzyme-producing probiotic bacteria isolated from the gastrointestinal tract of rainbow trout on the growth performance, feed conversion ratio, and digestive enzyme activity, of fry (Oncorhynchus mykiss). Three isolates (G8/2013, T7/2013 and U5/2013) of candidate bacteria elicited the highest protease, lipase, and amylase activities, respectively. Isolates were identified as Aeromonas sp., Bacillus sp. and Citrobacter braakii by morphological, physiological, biochemical characterizations as well as 16S rRNA gene sequence analysis. The fry basal diet was supplemented with probiotics at varying concentrations; G8 group, Aeromonas sp. 1.72 x 108 CFU/g; U5 group, Bacillus sp. 3.01 x 108 CFU/g; T7 group, C. braakii 2.96 x 108 CFU/g and a mixed group (same bacterial concentrations), and control group (no bacteria). The rainbow trout fry were fed ad libitum in triplicate treatments with supplemented and non-supplemented probiotic diets for 70-days. The total bacterial count in the intestine was significantly higher in the mixed group (30th and 50th days) and U5 group (50th and 70th days) compared with the control group. However, there was no significant difference in weight gain, specific growth rate (SGR), feed conversion ratio (FCR), nutrient digestibility, or digestive enzyme activity among the groups.

Development and evaluation of a multiplex PCR assay for simultaneous detection of Flavobacterium psychrophilum, Yersinia ruckeri and Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida in culture fisheries

Bacterial cold water disease, enteric red mouth disease and frunculosis are the common bacterial diseases of fish worldwide. The etiologic agents of these diseases are Flavobacterium (F.) psychrophilum, Yersinia (Y.) ruckeri and Aeromonas (A.) salmonicida subsp. salmonicida, respectively. In this study, a multiplex polymerase chain reaction (m-PCR) method with YER8/10-Fer3/4-FP1/3 primer pairs which can identify these fish pathogens simultaneously was developed and optimized. In optimized conditions, neither false specific nor nonspecific amplification occurred. The detection limits of the m-PCR method using DNA extracts from dilutions of pure cultures of bacteria were 35 pg for Y. ruckeri and F. psychrophilum and 70 pg for A. salmonicida subsp. salmonicida. It was determined that 15 CFU Y. ruckeri and F. psychrophilum and 30 CFU A. salmonicida subsp. salmonicida could be detected by m-PCR developed using genomic DNA extracted from dilutions of the suspensions. The detection limits in the presence of tissue debris were 125 CFU for Y. ruckeri and F. psychrophilum and 250 CFU for A. salmonicida subsp. salmonicida. In conclusion, we submit that the m-PCR method developed and optimized in this study can be used for accurate and rapid identification of these bacteria

Phenotypic and Genotypic Determination of Antimicrobial Resistance Profile for Lactococcus garvieae Isolates

Antimikrobiyel ajanların su ürünleri yetiştiriciliğindeki yoğun ve bilinçsiz kullanımı sucul ortamda antibiyotik dirençli bakterilerin ve antibiyotik direnç genlerinin oluşumuna neden olmaktadır. Bu gibi durumlarda su ve sediment antibiyotik direnç genleri için rezervuar durumuna dönüşebilir ve bu genler horizontal gen transferi ile insan ve balık patojenleri arasında yayılabilirler. Bu çalışmada Türkiye’nin değişik bölgelerinden izole edilmiş 25 L. garvieae izolatının 14 farklı antibiyotiğe karşı duyarlılıkları Kirby Bauer disk difüzyon yöntemiyle belirlendi. İzolatların sahip oldukları çeşitli antibiyotik direnç genlerinin varlığı spesifik primer çiftlerinin kullanıldığı PCR metodu ile belirlendi. Ayrıca izolatlar arasındaki olası klonal ilişkiler RAPD-PCR metodu ile ortaya konuldu. İzolatların tamamının en az 4 farklı antibiyotiğe karşı dirençli olduğu, bir izolatın ise 9 farklı antibiyotiğe karşı direnç ile en yüksek direnç profiline sahip olduğu belirlendi. İzolatlardan birinin (%4) sulI direnç genine, altısının (%24) sulII direnç genine ve bir izolatın (%4) tetD direnç genine sahip olduğu belirlendi. İzolatların ERIC2 primeri ile 3 farklı genotipe ayrıldığı ve izolatların büyük bir bölümünün (16 izolat) baskın tip olan LG2 genotipine dahil olduğu belirlendi. Çalışmada çoklu ilaç direncinin yüksek oranda saptanması balık hastalıklarının tedavisinde uygun antimikrobiyel ajanların seçilmesinin önemini ortaya koymaktadır.The intense and unconscious use of antimicrobial agents in aquaculture results in the occurrence of antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes (ARGs). In such cases, water and sediment may become a reservoir for ARGs and these genes can be transferred horizontally among fish and human pathogens. In the current study, antimicrobial activity of 25 L. garvieae strains isolated from different regions of Turkey was determined by Kirby Bauer disk diffusion method against the 14 different antibiotics. Presence of various antibiotic resistance genes in the isolates was determined by PCR method with specific primers. Additionally, possible clonal relationships between isolates were demonstrated by the RAPD-PCR method. All isolates have resistant to at least 4 different antibiotics, also one isolate had the highest resistance profile with resistance to 9 different antibiotics. It was determined that one of the isolates (4%) has SulI resistance gene, six (24%) of isolates have the sulII resistance gene and one isolate (4%) has tetD resistance gene. It was determined that the isolates were divided into 3 different genotypes by the ERIC2 primer and large amount of the isolates (16 isolates) have involved dominant type LG2 genotype. Detection of high rate multi-drug resistance in the study, suggested that selection of appropriate antimicrobial agents is important for treatment of fish diseases

Detection of methicillin resistance and slime factor production of Staphylococcus aureus in bovine mastitis

This study aimed to detect methicillin resistant and slime producing Staphylococcus aureus in cases of bovine mastitis. A triplex PCR was optimized targetting 16S rRNA, nuc and mecA genes for detection of Staphylococcus species, S. aureus and methicillin resistance, respectively. Furthermore, for detection of slime producing strains, a PCR assay targetting icaA and icaD genes was performed. In this study, 59 strains were detected as S. aureus by both conventional tests and PCR, and 13 of them were found to be methicillin resistant and 4 (30.7%) were positive for mecA gene. Although 22 of 59 (37.2%) S. aureus isolates were slime-producing in Congo Red Agar, in PCR analysis only 15 were positive for both icaA and icaD genes. Sixteen and 38 out of 59 strains were positive for icaA and icaD gene, respectively. Only 2 of 59 strains were positive for both methicillin resistance and slime producing, phenotypically, suggesting lack of correlation between methicillin resistance and slime production in these isolates. In conclusion, the optimized triplex PCR in this study was useful for rapid and reliable detection of methicillin resistant S. aureus. Furthermore, only PCR targetting icaA and icaD may not sufficient to detect slime production and further studies targetting other ica genes should be conducted for accurate evaluation of slime production characters of S. aureus strains

Isolation and Characterization of Potential Probiotic Bacteria from Rainbow Trout Oncorhynchus mykiss, (Walbaum) Rearing Units Against Bacterial Pathogens

Bacteria were studied for potential probiotic activity against vibriosis, yersiniosis and lactococcosis in rainbow trout. A total of 79 bacterial strains were isolated from rainbow trout rearing water, and screened for antagonistic activity against Vibrio anguillarum, Yersinia ruckeri and Lactococcus garvieae using a well-diffusion agar assay. Vibrio spp. showed inhibitory activity against V. anguilarum and L. garvieae, while Aeromonas spp. displayed antagonistic activity against L. garvieae. Antagonistic L. garvieae strains displayed inhibitory activity against all pathogens. Antagonistic strains were characterized for enzymatic activity (protease, lipase) and hydrophobicity. Vibrio sp. A12, and Aeromonas sp. A5, G1, were found to have enzymatic properties and hydrophobicity. L. garvieae strains showed weak hydrophobicity and did not display enzymatic activity. Phenotypic characteristics of antagonistic strains were determined by conventional API 20NE and API STREP rapid identification systems. Antagonistic L. garvieae strains were confirmed as L. garvieae by PCR using species-specific primers. Candidate probiotic strains were tested for pathogenicity in rainbow trout by intraperitoneal injection. Following a challenge, L. garvieae strains caused mortality and were eliminated from further study. As a result, Aeromonas spp. and Vibrio spp. were identified as probiotic candidates with the potential to control vibriosis and lactococcosis